O trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade genética e a distribuição geográfica e ambiental de espécies de Didymella associadas ao capim-amargoso (Digitaria insularis) nos estados de Minas Gerais, Goiás e São Paulo. Foram analisados 25 isolados por meio de marcadores moleculares ITS e rpb2, com avaliações filogenéticas, haplotípicas e geoespaciais. Os resultados evidenciaram a predominância de Didymella digitariae, correspondente a 72% dos isolados, e a identificação de seis haplótipos, sem estruturação geográfica evidente. O estudo relata, pela primeira vez no Brasil e no mundo, uma nova espécie, Didymella digitariae, causando lesões necróticas em D. insularis. Esses resultados ampliam o conhecimento sobre a diversidade e a distribuição de Didymella associadas ao capim-amargoso e fornecem subsídios para futuras pesquisas sobre o potencial desses fungos no controle biológico dessa planta daninha.